Prezentace ze seminářů a další studijní materiály  
 
Druhý ročník, 2002/2003
  Co je SiRNA

  RNA interference

     Vysvětlení, co to je siRNA, souvisí s fenoménem RNA interference, původně popsaným u rostlin, mušky Drosophily a červíka Caenorhabditis elegans. Jde o post-transkripční útlum exprese genu jestliže se v buňce objeví dvouvláknová RNA homologní s daným genem.
     Mechanismus RNA interference je následující:
  1. Nejprve je dvouvláknová RNA štěpena RNázou nazvanou Dicer na krátké štěpy dvouvláknové RNA 21-23 bp, s 2-3 bázemi přečnívajícími na 3´ koncích
  2. Tyto štěpy, nazvané small interfering RNA (siRNA), následně interagují s velkým (cca 500 kDa) multiproteinovým komplexem zvaným RNA-inducing silencing complex (RISC).
  3. Helikázová aktivita RISC komplexu rozplete dvoušroubovici siRNA a jen jedno z vláken zůstane asociováno s komplexem.
  4. Toto vlákno siRNA pak navede celý komplex na mRNA vůči kterému je komplementární, nukleázová aktivita RISC komplexu tuto mRNA rozštěpí a tak zahájí jeí degradaci buněčnými RNázami.
     Výsledkem je degradace určité specifické mRNA. Původní molekula siRNA přitom není spotřebována, ve fázi vazby vlákna siRNA na mRNA může dokonce dojít k její amplifikaci: buněčné RNA-dependentní RNA polymerázy použijí vlákno siRNA jako primer a pokračují v syntéze dvouvláknové RNA, která je pak štěpena již zmíněnou nukleázou Dicer na další sekundární siRNA. Je to jedno z vysvětlení pro vysokou a relativně dlouhodobou účinnost RNA interference.
     Dvouvláknová RNA v normálním procesu exprese genetické informace nevzniká, je zato častým intermediátem při replikaci virů. Všechny eukaryotické buňky tudíž reagují na přítomnost dvouvláknové RNA a primární funkcí RNA interference u rostlin a bezobratlých je obrana proti aktivitě virů a transposonů.
     V savčích buňkách je hlavním obranným mechanismem, spuštěným přítomností dvouvláknové RNA delší než asi 30 bp indukce syntézy interferonu, ten způsobí nespecifickou degradaci RNA, inhibici proteosyntézy a nakonec apoptosu infikovaných buněk. Nicméně i savčí buňky mají RNasu Dicer a uměle vnesené siRNA i v nich vyvolají RNA interferenci, i když bez amplifikace RNA-dependentními RNA polymerasami.
 
  StRNA a MiRNA

     Small temporal RNA (stRNA) je označení pro produkty dvou genů, které u červíka C. elegans kontrolují larvální vývoj. Transkripty těchto genů nekódují proteiny, ale RNA, které se skládají do vlásenkové ("hair-pin") struktury. Již zmíněná RNáza Dicer z nich vyštípne fragmenty konečných small temporal RNA (stRNA) o délce 21-22 bp, tj. přesně stejně dlouhé jako siRNA, ovšem jednovláknové. Tyto stRNA následně interagují s proteinovým komplexem analogickým RISC, a párují se s homologními úseky na 3´ koncích cílových regulovaných mRNA. Na rozdíl od siRNA ale nezpůsobí degradaci mRNA, jen inhibici translace.
     Další výzkum nalezl i v lidských buňkách doslova desítky různých takovýchto malých RNA. Zatím označovány jako microRNA (miRNA) a bez konkrétní funkce, ale je pravděpodobné že regulují genovou expresi při vývoji tkáně a dalších buněčných aktivitách. Původně popsaná RNA interference tak možná je jen špičkou ledovce vyčnívajícího z moře aktivit malých RNA.
 
  Využití siRNA

     Co je však jasné už dnes, je to, že možnost selektivně a specificky utlumit expresi určitého genu v savčí buňce vnesením syntetické siRNA má rozsáhlé praktické využití. Tato technologie se totiž zdá mnohem jednodušší a účinnější než dosud používané genové knock-outy, anti-sense oligonukleotidy nebo ribozymy. Slibná je zejména možnost infikovat buňku plasmidem nebo virovým vektorem obsahujícím DNA sekvenci kódující RNA o vlásenkové struktuře, ze které pak Dicer v buňce vystřihne efektorový fragment analogicky jako u endogenních stRNA a miRNA.
     Ve funkční genomice umožňuje použití siRNA cílenou inaktivaci jednotlivých genů a tak zjištění, jakou mají v buňce funkci.
     SiRNA se dále může uplatnit v antivirové terapii, zejména se o nich uvažuje jako o další strategii proti viru HIV. Cílem přitom nemusí být jen rychle mutující RNA genom viru nebo jeho transkripty, ale i buněčné receptory pro HIV virus, CD4 nebo CC chemokin receptor 5, nebo protein rev, který virová RNA potřebuje pro export z jádra. Obdobná strategie může fungovat i na jiné viry nebo v genové terapii obecně, a tak se zdá, že v prastarém mechanismu RNA interference se skrývá obrovský terapeutický potenciál.
 
  Literatura:

Kitabwalla M, Ruprecht RM: RNA interference - a new weapon against HIV and beyond. N. Eng. J. Med. 2002; 347 (17): 1364-7.
McManus MT, Sharp PA: Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat. Rev. Genet. 2002; 3 (10): 737-47.
Cullen BR: RNA interference: antiviral defense and genetic tool. Nat. Immunol. 2002; 3 (7): 597-9.
Ahlquist P: RNA-dependent RNA polymerases, viruses, and RNA silencing. Science 2002; 296 (5571): 1270-3.
Moss EG: RNA interference: it's a small RNA world. Curr. Biol. 2001; 11 (19): R772-5.
 
 

MUDr. Jan Pláteník, PhD.
 
 
 
  .:: created by Lukáš Mikšík, lukas@miksik.com :: edited by Jan Pláteník, jplat@lf1.cuni.cz